Hai! Saya seorang pemasok sel Tet - 213, dan hari ini saya akan memandu Anda melalui cara melakukan pewarnaan imunofluoresensi pada sel -sel ini. Pewarnaan imunofluoresensi adalah teknik yang sangat berguna di dunia biologi sel. Ini membantu kami memvisualisasikan protein spesifik dalam sel, memberi kami pemahaman yang lebih baik tentang fungsi dan lokasi mereka.
Mempersiapkan Tet - 213 sel
Hal pertama yang pertama, kita perlu menyiapkan TET - 213 sel kita. Mulailah dengan menanamnya dalam media budaya yang tepat. Sel -sel ini biasanya bekerja dengan baik dalam medium seperti RPMI 1640 yang ditambah dengan 10% serum sapi janin (FBS) dan penisilin 1% - streptomisin. Inkubasi sel pada suhu 37 ° C di atmosfer 5%.
Setelah sel mencapai sekitar 70 - 80% pertemuan, saatnya untuk memulai proses pewarnaan. Anda harus menyemai sel -sel ke dalam penutup dalam piring 24 - sumur. Ini membuatnya lebih mudah untuk menangani sel selama langkah pewarnaan. Gunakan pipet untuk mentransfer suspensi sel dengan hati -hati ke coverlips. Pastikan untuk mendistribusikan sel secara merata.
Memperbaiki sel
Setelah sel melekat pada penutup (biasanya setelah 24 jam), saatnya untuk memperbaikinya. Fiksasi sangat penting karena mempertahankan struktur sel dan menjaga protein tetap di tempatnya. Anda dapat menggunakan fiksatif seperti 4% paraformaldehyde (PFA) dalam fosfat - buffered saline (PBS). Tambahkan PFA yang cukup untuk menutupi sel -sel pada penutup dan diamkan pada suhu kamar selama sekitar 15 - 20 menit.
Setelah fiksasi selesai, cuci sel tiga kali dengan PBS. Setiap pencucian harus berlangsung selama sekitar 5 menit. Ini membantu menghilangkan kelebihan fiksatif dari sel.
Permeabilisasi
Selanjutnya adalah permeabilisasi. Langkah ini memungkinkan antibodi untuk memasuki sel dan mengikat protein target. Gunakan agen permeabilisasi seperti 0,1% Triton X - 100 di PBS. Tambahkan solusi permeabilisasi ke sel dan diamkan pada suhu kamar selama sekitar 10 menit.
Setelah itu, cuci sel tiga kali dengan PBS lagi, seperti pada langkah sebelumnya. Ini memastikan bahwa agen permeabilisasi benar -benar dihapus.
Pemblokiran
Pemblokiran adalah langkah penting untuk mencegah pengikatan antibodi yang tidak spesifik. Anda dapat menggunakan solusi pemblokiran seperti 5% Bovine Serum Albumin (BSA) di PBS. Tambahkan solusi pemblokiran ke sel dan diamkan pada suhu kamar selama sekitar 1 jam.
Inkubasi antibodi primer
Sekarang saatnya menambahkan antibodi utama. Antibodi primer khusus untuk protein yang ingin Anda deteksi dalam sel Tet - 213. Encerkan antibodi primer dalam solusi pemblokiran sesuai dengan instruksi pabrik.
Hati -hati lepaskan larutan pemblokiran dari sel dan tambahkan antibodi primer yang diencerkan. Pastikan untuk menutupi sel sepenuhnya dengan larutan antibodi. Inkubasi sel dengan antibodi primer semalaman pada suhu 4 ° C. Waktu inkubasi yang lama ini memungkinkan antibodi untuk mengikat secara efektif ke protein target.
Keesokan harinya, cuci sel tiga kali dengan PBS, dengan masing -masing cuci berlangsung sekitar 5 menit. Ini menghilangkan antibodi primer yang tidak terikat.
Inkubasi Antibodi Sekunder
Setelah inkubasi antibodi primer, saatnya untuk antibodi sekunder. Antibodi sekunder diberi label dengan pewarna fluoresen, yang memungkinkan kita untuk memvisualisasikan protein target di bawah mikroskop fluoresensi.
Encerkan antibodi sekunder dalam solusi pemblokiran sesuai instruksi pabrik. Lepaskan PBS dari sel dan tambahkan antibodi sekunder yang diencerkan. Inkubasi sel pada suhu kamar selama sekitar 1 - 2 jam dalam gelap. Lingkungan gelap penting untuk mencegah pewarna fluoresen memudar.
Setelah inkubasi selesai, cuci sel tiga kali dengan PBS, seperti sebelumnya.
Counterstain
Counterstain digunakan untuk memvisualisasikan inti sel. Anda dapat menggunakan pewarna seperti DAPI (4 ', 6 - Diamidino - 2 - Phenylindole). Encerkan DAPI dalam PBS dan tambahkan ke sel. Biarkan diinkubasi pada suhu kamar selama sekitar 5 menit.
Setelah itu, cuci sel sekali lagi dengan PBS untuk menghilangkan kelebihan DAPI.
Pemasangan
Akhirnya, saatnya untuk memasang coverlips ke slide mikroskop. Gunakan media pemasangan, yang membantu menjaga sel tetap di tempat dan juga mempertahankan fluoresensi. Tempatkan setetes media pemasangan dengan hati -hati pada slide mikroskop dan kemudian balikkan penutup ke atas tetes. Pastikan tidak ada gelembung udara yang terperangkap di antara coverlip dan slide.
Pencitraan
Sekarang Anda siap untuk gambar sel di bawah mikroskop fluoresensi. Gunakan filter yang sesuai untuk memvisualisasikan sinyal fluoresen dari antibodi sekunder dan DAPI. Anda dapat mengambil beberapa gambar di berbagai bidang pandang untuk mendapatkan representasi sel yang baik.
Menggunakan peptida terkait dalam proses
Selama kultur sel dan proses pewarnaan, Anda mungkin juga menemukan beberapa peptida yang berguna. Misalnya,(Gly14) -Humanin (manusia)telah terbukti memiliki beberapa efek menguntungkan pada viabilitas dan fungsi sel. Anda dapat menambahkannya ke media kultur untuk melihat apakah itu mempengaruhi ekspresi protein yang Anda pelajari di sel Tet - 213.
Fibronectin CS1 peptidadapat digunakan untuk melapisi penutup sebelum menyemai sel. Ini dapat meningkatkan perlekatan dan penyebaran sel, membuat proses pewarnaan lebih efisien.
Endothelin - 1 (11 - 21)Mungkin juga berperan dalam jalur pensinyalan dalam sel Tet - 213. Anda dapat menambahkannya ke media kultur dan kemudian mempelajari bagaimana hal itu mempengaruhi ekspresi protein target melalui pewarnaan imunofluoresensi.
Kesimpulan
Melakukan pewarnaan imunofluoresensi pada TET - 213 sel bisa menjadi sedikit proses yang rumit, tetapi jika Anda mengikuti langkah -langkah ini dengan hati -hati, Anda harus bisa mendapatkan beberapa hasil yang bagus. Ini adalah teknik yang kuat yang dapat memberi Anda wawasan berharga tentang biologi sel -sel ini.
Jika Anda tertarik untuk membeli TET - 213 sel atau peptida terkait yang disebutkan di blog ini, jangan ragu untuk menjangkau kami untuk informasi lebih lanjut dan memulai diskusi pengadaan. Kami di sini untuk membantu Anda dengan semua kebutuhan biologi sel Anda.
Referensi
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2002). Biologi molekuler sel. Ilmu Garland.
- Pollard, TD, & Earnshaw, WC (2004). Biologi Sel. Saunders.