Transfeksi adalah teknik penting dalam biologi molekuler yang memungkinkan pengenalan asam nukleat asing ke dalam sel, memungkinkan para peneliti untuk mempelajari fungsi gen, ekspresi protein, dan jalur pensinyalan seluler. Sel TET-213, garis sel neuroblastoma manusia, umumnya digunakan dalam penelitian ilmu saraf karena sifat neuronnya. Dalam posting blog ini, saya akan membagikan beberapa wawasan tentang cara mentransfeksi sel TET-213 secara efektif, menggambar pada pengalaman saya sebagai pemasok sel TET-213.
Memahami sel TET-213
Sebelum mempelajari proses transfeksi, penting untuk memahami karakteristik sel TET-213. Sel -sel ini berasal dari neuroblastoma manusia dan menunjukkan fitur neuron seperti kemampuan untuk memperluas neurit dan mengekspresikan penanda neuron. Mereka adalah sel yang patuh yang tumbuh dengan baik dalam kondisi kultur sel standar, biasanya dalam medium yang dilengkapi dengan serum sapi janin (FBS) dan antibiotik.
Memilih metode transfeksi yang tepat
Ada beberapa metode yang tersedia untuk mentransfeksi sel, masing -masing dengan keuntungan dan keterbatasannya sendiri. Pilihan metode transfeksi tergantung pada berbagai faktor, termasuk jenis asam nukleat yang akan ditransfeksi, jenis sel, dan efisiensi transfeksi yang diinginkan. Berikut adalah beberapa metode transfeksi umum yang cocok untuk sel TET-213:
Transfeksi berbasis lipid
Transfeksi berbasis lipid adalah salah satu metode yang paling banyak digunakan untuk memasukkan asam nukleat ke dalam sel. Ini melibatkan penggunaan reagen berbasis lipid yang membentuk kompleks dengan asam nukleat, yang kemudian diambil oleh sel melalui endositosis. Transfeksi berbasis lipid relatif mudah dilakukan dan dapat mencapai efisiensi transfeksi yang tinggi dalam banyak jenis sel, termasuk sel TET-213.
Elektroporasi
Elektroporasi adalah metode fisik yang menggunakan medan listrik untuk membuat pori -pori sementara di membran sel, memungkinkan asam nukleat memasuki sel. Metode ini sangat berguna untuk mentransfeksi sel yang sulit ditransfeksi menggunakan metode lain, seperti sel primer. Namun, elektroporasi dapat lebih merusak sel dan mungkin memerlukan optimalisasi parameter elektroporasi untuk mencapai efisiensi transfeksi yang tinggi.
Transduksi virus
Transduksi virus melibatkan penggunaan vektor virus untuk mengirimkan asam nukleat ke dalam sel. Vektor virus berasal dari virus yang telah direkayasa untuk membawa asam nukleat yang diinginkan dan dapat menginfeksi sel secara efisien. Transduksi virus dapat mencapai efisiensi transfeksi yang tinggi dan dapat digunakan untuk mentransfeksi berbagai jenis sel, termasuk sel TET-213. Namun, transduksi virus membutuhkan peralatan dan keahlian khusus, dan ada potensi masalah keamanan yang terkait dengan penggunaan vektor virus.
Mempersiapkan Sel untuk Transfeksi
Persiapan sel yang tepat sangat penting untuk keberhasilan transfeksi. Berikut adalah beberapa langkah yang harus diikuti saat menyiapkan sel TET-213 untuk transfeksi:
Kultur sel
Pertahankan sel TET-213 dalam media kultur sel yang sesuai dilengkapi dengan FBS dan antibiotik. Melintasi sel -sel secara teratur untuk mempertahankan fase pertumbuhan eksponensial mereka. Penting untuk menggunakan sel yang sehat dan tumbuh secara aktif untuk transfeksi, karena sel dalam keadaan fisiologis yang buruk mungkin memiliki efisiensi transfeksi yang lebih rendah.
Penyemaian sel
Benih sel TET-213 dalam hidangan kultur atau piring multi-sumur pada kepadatan yang sesuai. Kepadatan penyemaian tergantung pada metode transfeksi dan jenis percobaan. Untuk transfeksi berbasis lipid, kepadatan penyemaian 50-80% biasanya direkomendasikan.
Inkubasi sel
Inkubasi sel -sel yang diunggulkan dalam inkubator yang dilembabkan pada suhu 37 ° C dengan 5% CO2 selama setidaknya 24 jam sebelum transfeksi untuk memungkinkan sel -sel menempel dan pulih dari proses penyemaian.
Melakukan transfeksi
Setelah sel disiapkan, saatnya untuk melakukan transfeksi. Berikut adalah protokol umum untuk transfeksi berbasis lipid dari sel TET-213:
Siapkan reagen transfeksi
Ikuti instruksi pabrik untuk menyiapkan reagen transfeksi berbasis lipid. Biasanya, ini melibatkan mengencerkan reagen dalam media transfeksi yang sesuai.
Siapkan asam nukleat
Siapkan asam nukleat untuk ditransfeksi, seperti DNA plasmid atau siRNA. Encerkan asam nukleat dalam media transfeksi yang sesuai.
Membentuk kompleks transfeksi
Campur reagen transfeksi yang diencerkan dan asam nukleat yang diencerkan dalam tabung dan diinkubasi pada suhu kamar selama 15-30 menit untuk memungkinkan pembentukan kompleks transfeksi.
Tambahkan kompleks transfeksi ke sel
Hapus media kultur dari sel dan ganti dengan media transfeksi baru. Tambahkan kompleks transfeksi ke sel-sel yang bijaksana dan dengan lembut berputar piring untuk mendistribusikan kompleks secara merata.
Inkubasi sel
Inkubasi sel yang ditransfeksi dalam inkubator yang dilembabkan pada suhu 37 ° C dengan 5% CO2 untuk jumlah waktu yang tepat, tergantung pada jenis asam nukleat dan percobaan. Untuk transfeksi DNA plasmid, waktu inkubasi 24-48 jam biasanya cukup untuk memungkinkan ekspresi gen.
Menilai efisiensi transfeksi
Setelah transfeksi, penting untuk menilai efisiensi transfeksi untuk menentukan apakah transfeksi berhasil. Ada beberapa metode yang tersedia untuk menilai efisiensi transfeksi, termasuk:
Mikroskop fluoresensi
Jika asam nukleat yang ditransfeksi mengkodekan protein fluoresen, seperti GFP, mikroskop fluoresensi dapat digunakan untuk memvisualisasikan sel yang ditransfeksi. Persentase sel fluoresen dapat digunakan sebagai perkiraan efisiensi transfeksi.
Aliran sitometri
Flow cytometry dapat digunakan untuk mengukur persentase sel yang ditransfeksi berdasarkan ekspresi penanda fluoresen atau antigen permukaan sel. Metode ini memberikan ukuran efisiensi transfeksi yang lebih akurat dan kuantitatif dibandingkan dengan mikroskop fluoresensi.
Western blotting atau qPCR
Jika asam nukleat yang ditransfeksi mengkodekan protein yang menarik, western blotting atau qPCR dapat digunakan untuk mendeteksi ekspresi protein pada tingkat protein atau mRNA, masing -masing. Metode ini dapat memberikan informasi tentang tingkat ekspresi gen dan fungsionalitas protein yang ditransfeksi.
Memecahkan Masalah Masalah Transfeksi Umum
Transfeksi terkadang bisa menantang, dan ada beberapa masalah umum yang mungkin terjadi. Berikut adalah beberapa tips pemecahan masalah untuk masalah transfeksi umum:
Efisiensi transfeksi yang rendah
- Periksa kualitas dan kuantitas asam nukleat. Pastikan asam nukleat murni dan berkualitas tinggi.
- Mengoptimalkan kondisi transfeksi, seperti konsentrasi reagen transfeksi, rasio asam nukleat-ke-reagen, dan waktu inkubasi.
- Periksa kesehatan dan viabilitas sel. Pastikan sel -sel sehat dan tumbuh secara aktif sebelum transfeksi.
- Coba metode transfeksi atau reagen yang berbeda.
Toksisitas sel
- Kurangi konsentrasi reagen transfeksi atau asam nukleat.
- Optimalkan kondisi transfeksi untuk meminimalkan kerusakan sel.
- Gunakan metode transfeksi atau reagen yang berbeda yang kurang beracun bagi sel.
Efisiensi transfeksi variabel
- Pastikan sel diunggulkan secara merata dan pada kepadatan yang sesuai.
- Campur kompleks transfeksi secara menyeluruh sebelum menambahkannya ke sel.
- Inkubasi sel dalam kondisi yang konsisten untuk meminimalkan variabilitas.
Kesimpulan
Mentransfeksi sel TET-213 dapat menjadi proses yang menantang tetapi bermanfaat. Dengan memilih metode transfeksi yang tepat, menyiapkan sel dengan benar, dan mengikuti protokol yang sesuai, Anda dapat mencapai efisiensi transfeksi yang tinggi dan mendapatkan hasil yang dapat diandalkan. Jika Anda memiliki pertanyaan atau memerlukan bantuan lebih lanjut dengan transfeksi sel TET-213, jangan ragu untuk menghubungi kami. Kami adalah pemasok terkemuka sel TET-213 dan dapat memberi Anda sel berkualitas tinggi, reagen transfeksi, dan dukungan teknis.
Selain sel TET-213, kami juga menawarkan berbagai peptida, termasukGalana (manusia),Cyclo (RGDFC), DanDynorphin A (1-13), amida, babi. Peptida ini dapat digunakan dalam berbagai aplikasi penelitian, seperti ilmu saraf, penelitian kanker, dan penemuan obat.
Jika Anda tertarik untuk membeli sel TET-213 atau peptida kami, silakan hubungi kami untuk membahas kebutuhan spesifik Anda. Kami berharap dapat bekerja sama dengan Anda dan membantu Anda mencapai tujuan penelitian Anda.
Referensi
- Sambrook, J., & Russell, DW (2001). Kloning Molekuler: Manual Laboratorium. Pers Laboratorium Cold Spring Harbor.
- Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, RE, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA, & Struhl, K. (Eds.). (2002). Protokol saat ini dalam biologi molekuler. John Wiley & Sons.
- Chen, C., & Okayama, H. (1987). Transformasi efisiensi tinggi sel mamalia oleh DNA plasmid. Biologi molekuler dan seluler, 7 (8), 2745-2752.
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., & Hofschneider, Ph (1982). Transfer gen ke sel lyoma tikus dengan elektroporasi di medan listrik tinggi. EMBO Journal, 1 (7), 841-845.
- Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, FH, ... & Verma, IM (1996). Pengiriman gen in vivo dan transduksi sel yang tidak menyala oleh vektor lentiviral. Sains, 272 (5259), 263-267.